Η Javascript είναι απενεργοποιημένη αυτήν τη στιγμή στο πρόγραμμα περιήγησής σας.Όταν η Javascript είναι απενεργοποιημένη, ορισμένες λειτουργίες αυτού του ιστότοπου δεν θα λειτουργούν.
Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Philippe Deprez Department of Science, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalonia, Ισπανία * Αυτοί οι συγγραφείς έχουν κάποιες γνώσεις σχετικά με αυτό το έργο Υπόβαθρο συμβολής: Το υαλουρονικό οξύ (ΗΑ) είναι ένας φυσικός πολυσακχαρίτης που χρησιμοποιείται στην παραγωγή δερματικών πληρωτικών για αισθητικούς σκοπούς.Δεδομένου ότι έχει χρόνο ημιζωής αρκετών ημερών στους ανθρώπινους ιστούς, τα δερματικά πληρωτικά με βάση το HA τροποποιούνται χημικά για να παρατείνουν τη ζωή τους στο σώμα.Η πιο κοινή τροποποίηση στα εμπορικά πληρωτικά με βάση το ΗΑ είναι η χρήση του διγλυκιδυλαιθέρα 1,4-βουτανοδιόλης (BDDE) ως παράγοντα σταυροσύνδεσης για τη διασύνδεση των αλυσίδων ΗΑ.Η υπολειμματική ή μη αντιδρούσα BDDE θεωρείται μη τοξική σε <2 μέρη ανά εκατομμύριο (ppm).Επομένως, η υπολειμματική BDDE στο τελικό δερματικό πληρωτικό πρέπει να ποσοτικοποιηθεί για να διασφαλιστεί η ασφάλεια του ασθενούς.Υλικά και μέθοδοι: Αυτή η μελέτη περιγράφει την ανίχνευση και τον χαρακτηρισμό ενός παραπροϊόντος της αντίδρασης διασύνδεσης μεταξύ BDDE και HA υπό αλκαλικές συνθήκες με συνδυασμό υγρής χρωματογραφίας και φασματομετρίας μάζας (LC-MS).Αποτελέσματα: Μετά από διαφορετικές αναλύσεις, διαπιστώθηκε ότι οι αλκαλικές συνθήκες και η υψηλή θερμοκρασία που χρησιμοποιήθηκαν για την απολύμανση της υδρογέλης HA-BDDE προώθησαν τον σχηματισμό αυτού του νέου παραπροϊόντος, της ένωσης «όπως η προπυλενογλυκόλη».Η ανάλυση LC-MS επιβεβαίωσε ότι το παραπροϊόν έχει την ίδια μονοϊσοτοπική μάζα με το BDDE, διαφορετικό χρόνο κατακράτησης (tR) και διαφορετικό τρόπο απορρόφησης UV (λ=200 nm).Σε αντίθεση με το BDDE, παρατηρήθηκε στην ανάλυση LC-MS ότι κάτω από τις ίδιες συνθήκες μέτρησης, αυτό το παραπροϊόν έχει υψηλότερο ρυθμό ανίχνευσης στα 200 nm.Συμπέρασμα: Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι δεν υπάρχει εποξείδιο στη δομή αυτής της νέας ένωσης.Η συζήτηση είναι ανοιχτή για την αξιολόγηση του κινδύνου αυτού του νέου παραπροϊόντος που βρίσκεται στην παραγωγή υδρογέλης HA-BDDE (δερματικό πληρωτικό HA) για εμπορικούς σκοπούς.Λέξεις-κλειδιά: υαλουρονικό οξύ, δερματικό πληρωτικό HA, διασυνδεδεμένο υαλουρονικό οξύ, BDDE, ανάλυση LC-MS, υποπροϊόν BDDE.
Τα πληρωτικά με βάση το υαλουρονικό οξύ (HA) είναι τα πιο κοινά και δημοφιλή δερματικά πληρωτικά που χρησιμοποιούνται για καλλυντικούς σκοπούς.1 Αυτό το δερματικό πληρωτικό είναι μια υδρογέλη, που συνήθως αποτελείται από >95% νερό και 0,5-3% HA, που τους δίνει μια δομή που μοιάζει με γέλη.Το 2 ΗΑ είναι ένας πολυσακχαρίτης και το κύριο συστατικό της εξωκυτταρικής μήτρας των σπονδυλωτών.Ένα από τα συστατικά.Αποτελείται από (1,4)-γλυκουρονικό οξύ-β (1,3)-Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (GlcNAc) επαναλαμβανόμενες μονάδες δισακχαρίτη που συνδέονται με γλυκοσιδικούς δεσμούς.Αυτό το πρότυπο δισακχαρίτη είναι το ίδιο σε όλους τους οργανισμούς.Σε σύγκριση με ορισμένα πληρωτικά που βασίζονται σε πρωτεΐνες (όπως το κολλαγόνο), αυτή η ιδιότητα καθιστά το ΗΑ ένα εξαιρετικά βιοσυμβατό μόριο.Αυτά τα πληρωτικά μπορούν να παρουσιάσουν ειδικότητα αλληλουχίας αμινοξέων που μπορεί να αναγνωριστεί από το ανοσοποιητικό σύστημα του ασθενούς.
Όταν χρησιμοποιείται ως δερματικό πληρωτικό, ο κύριος περιορισμός του ΗΑ είναι η ταχεία εναλλαγή του εντός των ιστών λόγω της παρουσίας μιας συγκεκριμένης οικογένειας ενζύμων που ονομάζονται υαλουρονιδάσες.Μέχρι στιγμής, έχουν περιγραφεί αρκετές χημικές τροποποιήσεις στη δομή του ΗΑ για την αύξηση του χρόνου ημιζωής του ΗΑ στους ιστούς.3 Οι περισσότερες από αυτές τις τροποποιήσεις προσπαθούν να μειώσουν την πρόσβαση της υαλουρονιδάσης σε πολυμερή πολυσακχαριτών διασυνδέοντας αλυσίδες ΗΑ.Επομένως, λόγω του σχηματισμού γεφυρών και των διαμοριακών ομοιοπολικών δεσμών μεταξύ της δομής ΗΑ και του παράγοντα διασύνδεσης, η διασυνδεδεμένη υδρογέλη ΗΑ παράγει περισσότερα προϊόντα αποικοδόμησης κατά των ενζύμων από το φυσικό ΗΑ.4-6
Μέχρι στιγμής, οι χημικοί παράγοντες διασύνδεσης που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή διασυνδεδεμένου ΗΑ περιλαμβάνουν μεθακρυλαμίδιο, 7 υδραζίδιο, 8 καρβοδιιμίδιο, 9 διβινυλοσουλφόνη, διγλυκιδυλαιθέρα 1,4-βουτανοδιόλης (BDDE) και πολυ(αιθυλενογλυκόλη) διγλυκιδυλαιθέρα.10,11 Το BDDE είναι επί του παρόντος ο πιο συχνά χρησιμοποιούμενος παράγοντας διασύνδεσης.Αν και αυτοί οι τύποι υδρογέλης έχουν αποδειχθεί ασφαλείς εδώ και δεκαετίες, οι παράγοντες διασύνδεσης που χρησιμοποιούνται είναι αντιδραστήρια που μπορεί να είναι κυτταροτοξικά και, σε ορισμένες περιπτώσεις, μεταλλαξιογόνα.12 Επομένως, η υπολειμματική περιεκτικότητά τους στην τελική υδρογέλη πρέπει να είναι υψηλή.Το BDDE θεωρείται ασφαλές όταν η υπολειπόμενη συγκέντρωση είναι μικρότερη από 2 μέρη ανά εκατομμύριο (ppm).4
Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι για την ανίχνευση της συγκέντρωσης BDDE χαμηλού υπολείμματος, του βαθμού διασύνδεσης και της θέσης υποκατάστασης σε υδρογέλες ΗΑ, όπως η αέρια χρωματογραφία, η χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας (MS), μέθοδοι μέτρησης φθορισμού πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) και Υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης συζευγμένη με διάταξη διόδων (HPLC).13-17 Αυτή η μελέτη περιγράφει την ανίχνευση και τον χαρακτηρισμό ενός παραπροϊόντος στην τελική υδρογέλη HA με σταυροδεσμούς που παράγεται από την αντίδραση BDDE και HA υπό αλκαλικές συνθήκες.HPLC και υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μάζας (ανάλυση LC-MS).Δεδομένου ότι η τοξικότητα αυτού του παραπροϊόντος του BDDE είναι άγνωστη, συνιστούμε να προσδιορίζεται η ποσοτικοποίηση των υπολειμμάτων του με παρόμοιο τρόπο με τη μέθοδο που συνήθως εκτελείται στο BDDE στο τελικό προϊόν.
Το λαμβανόμενο άλας νατρίου του ΗΑ (Shiseido Co., Ltd., Τόκιο, Ιαπωνία) έχει μοριακό βάρος ~1.368.000 Da (μέθοδος Laurent) 18 και εγγενές ιξώδες 2,20 m3/kg.Για την αντίδραση διασύνδεσης, BDDE (≥95%) αγοράστηκε από τη Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ).Αλατούχο διάλυμα ρυθμισμένο με φωσφορικά με ρΗ 7,4 αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich Company.Όλοι οι διαλύτες, το ακετονιτρίλιο και το νερό που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση LC-MS αγοράστηκαν από ποιότητα ποιότητας HPLC.Το μυρμηκικό οξύ (98%) αγοράζεται ως βαθμού αντιδραστηρίου.
Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σε ένα σύστημα UPLC Acquity (Waters, Milford, MA, ΗΠΑ) και συνδέθηκαν με ένα τριπλό τετραπολικό φασματόμετρο μάζας API 3000 εξοπλισμένο με μια πηγή ιονισμού ηλεκτροψεκασμού (AB SCIEX, Framingham, MA, USA).
Η σύνθεση των διασυνδεδεμένων υδρογέλης ΗΑ ξεκίνησε προσθέτοντας 198 mg BDDE σε διάλυμα 10% (β/β) υαλουρονικού νατρίου (NaHA) παρουσία 1% αλκαλίου (υδροξείδιο του νατρίου, NaOH).Η τελική συγκέντρωση BDDE στο μίγμα της αντίδρασης ήταν 9,9 mg/mL (0,049 mM).Κατόπιν, το μίγμα της αντίδρασης αναμίχθηκε επιμελώς και ομογενοποιήθηκε και αφέθηκε να προχωρήσει στους 45°C για 4 ώρες.19 Το pH της αντίδρασης διατηρείται στο ~12.
Στη συνέχεια, το μίγμα της αντίδρασης πλύθηκε με νερό και η τελική υδρογέλη ΗΑ-ΒϋϋΕ διηθήθηκε και αραιώθηκε με ρυθμιστικό διάλυμα PBS για να επιτευχθεί συγκέντρωση ΗΑ από 10 έως 25 mg/mL και τελικό ρΗ 7,4.Προκειμένου να αποστειρωθούν οι παραγόμενες υδρογέλες ΗΑ με σταυροδεσμούς, όλες αυτές οι υδρογέλες υποβάλλονται σε αυτόκλειστο (120°C για 20 λεπτά).Η καθαρισμένη υδρογέλη BDDE-HA αποθηκεύεται στους 4°C μέχρι την ανάλυση.
Για να αναλυθεί το BDDE που υπάρχει στο διασυνδεδεμένο προϊόν ΗΑ, ένα δείγμα 240 mg ζυγίστηκε και εισήχθη στην κεντρική οπή (Microcon®, Merck Millipore, Billerica, MA, USA, όγκος 0,5 mL) και φυγοκεντρήθηκε στις 10.000 rpm σε θερμοκρασία δωματίου 10 λεπτο.Συνολικά 20 μL υγρού έλξης προς τα κάτω συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν.
Προκειμένου να αναλυθεί το πρότυπο BDDE (Sigma-Aldrich Co) υπό αλκαλικές συνθήκες (1%, 0,1% και 0,01% NaOH), εάν πληρούνται οι ακόλουθες συνθήκες, το υγρό δείγμα είναι 1:10, 1:100 ή έως 1:1.000.000 Εάν είναι απαραίτητο, χρησιμοποιήστε απιονισμένο νερό MilliQ για ανάλυση.
Για τα υλικά έναρξης που χρησιμοποιήθηκαν στην αντίδραση διασύνδεσης (ΗΑ 2%, Η2Ο, 1% NaOH και 0,049 mM BDDE), 1 mL από κάθε δείγμα που παρασκευάστηκε από αυτά τα υλικά αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τις ίδιες συνθήκες ανάλυσης.
Για να προσδιοριστεί η ειδικότητα των κορυφών που εμφανίζονται στον χάρτη ιόντων, προστέθηκαν 10 μL προτύπου διαλύματος BDDE 100 ppb (Sigma-Aldrich Co) στο δείγμα 20 μL.Σε αυτή την περίπτωση, η τελική συγκέντρωση του προτύπου σε κάθε δείγμα είναι 37 ppb.
Αρχικά, παρασκευάστε ένα μητρικό διάλυμα BDDE με συγκέντρωση 11.000 mg/L (11.000 ppm) αραιώνοντας 10 μL τυπικού BDDE (Sigma-Aldrich Co) με 990 μL MilliQ νερού (πυκνότητα 1,1 g/mL).Χρησιμοποιήστε αυτό το διάλυμα για να παρασκευάσετε ένα διάλυμα BDDE 110 μg/L (110 ppb) ως ενδιάμεση πρότυπη αραίωση.Στη συνέχεια, χρησιμοποιήστε το ενδιάμεσο πρότυπο αραιωτικό BDDE (110 ppb) για να προετοιμάσετε την τυπική καμπύλη αραιώνοντας το ενδιάμεσο αραιωτικό αρκετές φορές για να επιτύχετε την επιθυμητή συγκέντρωση των 75, 50, 25, 10 και 1 ppb.Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, βρέθηκε ότι η τυπική καμπύλη BDDE από 1,1 έως 110 ppb έχει καλή γραμμικότητα (R2>0,99).Η τυπική καμπύλη επαναλήφθηκε σε τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.
Σχήμα 1 Πρότυπη καμπύλη βαθμονόμησης BDDE που ελήφθη με ανάλυση LC-MS, στην οποία παρατηρείται καλή συσχέτιση (R2>0,99).
Συντομογραφίες: BDDE, 1,4-βουτανοδιόλη διγλυκιδυλαιθέρας;LC-MS, υγρή χρωματογραφία και φασματομετρία μάζας.
Προκειμένου να προσδιοριστούν και να ποσοτικοποιηθούν τα πρότυπα BDDE που υπάρχουν στο διασυνδεδεμένο HA και τα πρότυπα BDDE στο βασικό διάλυμα, χρησιμοποιήθηκε ανάλυση LC-MS.
Ο χρωματογραφικός διαχωρισμός επιτεύχθηκε σε στήλη LUNA 2,5 μm C18(2)-HST (50×2,0 mm2, Phenomenex, Torrance, CA, USA) και διατηρήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου (25°C) κατά τη διάρκεια της ανάλυσης.Η κινητή φάση αποτελείται από ακετονιτρίλιο (διαλύτης Α) και νερό (διαλύτης Β) που περιέχει 0,1% μυρμηκικό οξύ.Η κινητή φάση εκλούεται με βαθμιδωτή έκλουση.Η κλίση έχει ως εξής: 0 λεπτά, 2% Α;1 λεπτό, 2% Α;6 λεπτά, 98% Α;7 λεπτά, 98% Α;7,1 λεπτά, 2% Α;10 λεπτά, 2% Α. Ο χρόνος λειτουργίας είναι 10 λεπτά και ο όγκος ένεσης είναι 20 µL.Ο χρόνος συγκράτησης του BDDE είναι περίπου 3,48 λεπτά (που κυμαίνεται από 3,43 έως 4,14 λεπτά βάσει πειραμάτων).Η κινητή φάση αντλήθηκε με ρυθμό ροής 0,25 mL/min για ανάλυση LC-MS.
Για ανάλυση BDDE και ποσοτικοποίηση με MS, το σύστημα UPLC (Waters) συνδυάζεται με ένα τριπλό τετραπολικό φασματόμετρο μάζας API 3000 (AB SCIEX) εξοπλισμένο με πηγή ιονισμού ηλεκτροψεκασμού και η ανάλυση εκτελείται σε λειτουργία θετικού ιόντος (ESI+).
Σύμφωνα με την ανάλυση θραύσματος ιόντων που πραγματοποιήθηκε σε BDDE, το θραύσμα με την υψηλότερη ένταση προσδιορίστηκε ότι είναι το θραύσμα που αντιστοιχεί σε 129,1 Da (Εικόνα 6).Επομένως, στη λειτουργία παρακολούθησης πολλαπλών ιόντων (MIM) για ποσοτικοποίηση, η μετατροπή μάζας (λόγος μάζας προς φόρτιση [m/z]) του BDDE είναι 203,3/129,1 Da.Χρησιμοποιεί επίσης λειτουργία πλήρους σάρωσης (FS) και λειτουργία σάρωσης ιόντων προϊόντος (PIS) για ανάλυση LC-MS.
Προκειμένου να επαληθευτεί η ειδικότητα της μεθόδου, αναλύθηκε ένα τυφλό δείγμα (αρχική κινητή φάση).Δεν ανιχνεύθηκε σήμα στο τυφλό δείγμα με μετατροπή μάζας 203,3/129,1 Da.Όσον αφορά την επαναληψιμότητα του πειράματος, αναλύθηκαν 10 τυπικές ενέσεις των 55 ppb (στο μέσον της καμπύλης βαθμονόμησης), με αποτέλεσμα την υπολειπόμενη τυπική απόκλιση (RSD) <5% (τα δεδομένα δεν φαίνονται).
Η υπολειπόμενη περιεκτικότητα σε BDDE προσδιορίστηκε ποσοτικά σε οκτώ διαφορετικά αποστειρωμένα σε αυτόκαυστο BDDE υδρογέλες ΗΑ με σταυροειδείς δεσμούς, που αντιστοιχούν σε τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα.Όπως περιγράφεται στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι», η ποσοτικοποίηση αξιολογείται από τη μέση τιμή της καμπύλης παλινδρόμησης της τυπικής αραίωσης BDDE, η οποία αντιστοιχεί στη μοναδική κορυφή που ανιχνεύεται στη μετάβαση μάζας BDDE 203,3/129,1 Da, με κατακράτηση χρόνος από 3,43 έως 4,14 λεπτά Χωρίς αναμονή.Το σχήμα 2 δείχνει ένα παράδειγμα χρωματογράμματος του προτύπου αναφοράς BDDE 10 ppb.Ο Πίνακας 1 συνοψίζει την υπολειμματική περιεκτικότητα σε BDDE οκτώ διαφορετικών υδρογέλης.Το εύρος τιμών είναι 1 έως 2,46 ppb.Επομένως, η υπολειπόμενη συγκέντρωση BDDE στο δείγμα είναι αποδεκτή για ανθρώπινη χρήση (<2 ppm).
Σχήμα 2 Χρωματόγραμμα ιόντων προτύπου αναφοράς BDDE 10 ppb (Sigma-Aldrich Co), μετάπτωση MS (m/z) που ελήφθη με ανάλυση LC-MS 203,30/129,10 Da (σε θετικό τρόπο MRM).
Συντομογραφίες: BDDE, 1,4-βουτανοδιόλη διγλυκιδυλαιθέρας;LC-MS, υγρή χρωματογραφία και φασματομετρία μάζας.MRM, παρακολούθηση πολλαπλών αντιδράσεων.MS, μάζα;m/z, αναλογία μάζας προς φόρτιση.
Σημείωση: Τα δείγματα 1-8 είναι υδρογέλες HA με διασταυρούμενη σύνδεση BDDE σε αυτόκλειστο.Αναφέρεται επίσης η υπολειπόμενη ποσότητα BDDE στην υδρογέλη και η κορυφή του χρόνου κατακράτησης BDDE.Τέλος, αναφέρεται και η ύπαρξη νέων κορυφών με διαφορετικούς χρόνους συγκράτησης.
Συντομογραφίες: BDDE, 1,4-βουτανοδιόλη διγλυκιδυλαιθέρας;HA, υαλουρονικό οξύ;MRM, παρακολούθηση πολλαπλών αντιδράσεων.tR, χρόνος κατακράτησης.LC-MS, υγρή χρωματογραφία και φασματομετρία μάζας.RRT, σχετικός χρόνος διατήρησης.
Παραδόξως, η ανάλυση του χρωματογράμματος ιόντων LC-MS έδειξε ότι με βάση όλα τα δείγματα υδρογέλης ΗΑ με διασταυρούμενη σύνδεση σε αυτόκλειστο που αναλύθηκαν, υπήρχε μια επιπλέον κορυφή στον μικρότερο χρόνο κατακράτησης από 2,73 έως 3,29 λεπτά.Για παράδειγμα, το Σχήμα 3 δείχνει το χρωματογράφημα ιόντων ενός δείγματος ΗΑ με σταυροδεσμούς, όπου εμφανίζεται μια επιπλέον κορυφή σε διαφορετικό χρόνο κατακράτησης περίπου 2,71 λεπτών.Ο παρατηρούμενος σχετικός χρόνος κατακράτησης (RRT) μεταξύ της πρόσφατα παρατηρούμενης κορυφής και της κορυφής από BDDE βρέθηκε να είναι 0,79 (Πίνακας 1).Εφόσον γνωρίζουμε ότι η κορυφή που παρατηρήθηκε πρόσφατα διατηρείται λιγότερο στη στήλη C18 που χρησιμοποιείται στην ανάλυση LC-MS, η νέα κορυφή μπορεί να αντιστοιχεί σε μια πιο πολική ένωση από το BDDE.
Σχήμα 3 Χρωματόγραμμα ιόντων δείγματος υδρογέλης ΗΑ με σταυροδεσμούς που ελήφθη με LC-MS (μετατροπή μάζας MRM 203.3/129.0 Da).
Συντομογραφίες: HA, υαλουρονικό οξύ;LC-MS, υγρή χρωματογραφία και φασματομετρία μάζας.MRM, παρακολούθηση πολλαπλών αντιδράσεων.RRT, σχετικός χρόνος κατακράτησης.tR, χρόνος κατακράτησης.
Προκειμένου να αποκλειστεί η πιθανότητα οι νέες κορυφές που παρατηρήθηκαν να είναι μολυσματικές ουσίες που υπήρχαν αρχικά στις πρώτες ύλες που χρησιμοποιήθηκαν, αυτές οι πρώτες ύλες αναλύθηκαν επίσης χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο ανάλυσης LC-MS.Οι πρώτες ύλες που αναλύθηκαν περιλαμβάνουν νερό, 2% NaHA σε νερό, 1% NaOH σε νερό και BDDE στην ίδια συγκέντρωση που χρησιμοποιείται στην αντίδραση διασύνδεσης.Το χρωματογράφημα ιόντων του υλικού έναρξης που χρησιμοποιήθηκε δεν έδειξε καμία ένωση ή κορυφή και ο χρόνος κατακράτησης αντιστοιχεί στη νέα κορυφή που παρατηρήθηκε.Αυτό το γεγονός απορρίπτει την ιδέα ότι όχι μόνο το αρχικό υλικό μπορεί να περιέχει οποιεσδήποτε ενώσεις ή ουσίες που μπορεί να παρεμποδίσουν τη διαδικασία ανάλυσης, αλλά δεν υπάρχει σημάδι πιθανής διασταυρούμενης μόλυνσης με άλλα εργαστηριακά προϊόντα.Οι τιμές συγκέντρωσης που ελήφθησαν μετά την ανάλυση LC-MS του BDDE και των νέων κορυφών φαίνονται στον Πίνακα 2 (δείγματα 1-4) και στο χρωματογράφημα ιόντων στο Σχήμα 4.
Σημείωση: Τα δείγματα 1-4 αντιστοιχούν στις πρώτες ύλες που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή υδρογέλης HA με διασταυρούμενη σύνδεση BDDE σε αυτόκλειστο.Αυτά τα δείγματα δεν υποβλήθηκαν σε αυτόκλειστο.
Συντομογραφίες: BDDE, 1,4-βουτανοδιόλη διγλυκιδυλαιθέρας;HA, υαλουρονικό οξύ;LC-MS, υγρή χρωματογραφία και φασματομετρία μάζας.MRM, παρακολούθηση πολλαπλών αντιδράσεων.
Το Σχήμα 4 αντιστοιχεί στο χρωματογράφημα LC-MS ενός δείγματος της πρώτης ύλης που χρησιμοποιείται στην αντίδραση διασύνδεσης ΗΑ και BDDE.
Σημείωση: Όλα αυτά μετρώνται στην ίδια συγκέντρωση και αναλογία που χρησιμοποιούνται για τη διεξαγωγή της αντίδρασης διασύνδεσης.Οι αριθμοί για τις πρώτες ύλες που αναλύθηκαν με το χρωματογράφημα αντιστοιχούν σε: (1) νερό, (2) υδατικό διάλυμα 2% ΗΑ, (3) υδατικό διάλυμα NaOH 1%.Πραγματοποιείται ανάλυση LC-MS για μετατροπή μάζας 203,30/129,10 Da (σε θετική λειτουργία MRM).
Συντομογραφίες: BDDE, 1,4-βουτανοδιόλη διγλυκιδυλαιθέρας;HA, υαλουρονικό οξύ;LC-MS, υγρή χρωματογραφία και φασματομετρία μάζας.MRM, παρακολούθηση πολλαπλών αντιδράσεων.
Μελετήθηκαν οι συνθήκες που οδήγησαν στο σχηματισμό νέων κορυφών.Προκειμένου να μελετηθεί πώς οι συνθήκες αντίδρασης που χρησιμοποιούνται για την παραγωγή της υδρογέλης με σταυροειδείς δεσμούς ΗΑ επηρεάζουν την αντιδραστικότητα του παράγοντα διασύνδεσης BDDE, οδηγώντας στον σχηματισμό νέων κορυφών (πιθανά παραπροϊόντα), πραγματοποιήθηκαν διαφορετικές μετρήσεις.Σε αυτούς τους προσδιορισμούς, μελετήσαμε και αναλύσαμε τον τελικό παράγοντα διασύνδεσης BDDE, ο οποίος υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις NaOH (0%, 1%, 0,1% και 0,01%) σε ένα υδατικό μέσο, ακολουθούμενο από ή χωρίς αυτόκαυστο.Η διαδικασία των βακτηρίων για την προσομοίωση των ίδιων συνθηκών είναι η ίδια με τη μέθοδο που χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή της υδρογέλης ΗΑ με σταυροδεσμούς.Όπως περιγράφεται στην ενότητα «Υλικά και Μέθοδοι», η μετάπτωση μάζας του δείγματος αναλύθηκε με LC-MS σε 203,30/129,10 Da.Το BDDE και η συγκέντρωση της νέας κορυφής υπολογίζονται και τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 3. Δεν ανιχνεύθηκαν νέες κορυφές στα δείγματα που δεν υποβλήθηκαν σε αυτόκλειστο, ανεξάρτητα από την παρουσία NaOH στο διάλυμα (δείγματα 1-4, Πίνακας 3).Για δείγματα σε αυτόκλειστο, νέες κορυφές ανιχνεύονται μόνο με την παρουσία NaOH στο διάλυμα και ο σχηματισμός της κορυφής φαίνεται να εξαρτάται από τη συγκέντρωση NaOH στο διάλυμα (δείγματα 5-8, Πίνακας 3) (RRT = 0,79).Το Σχήμα 5 δείχνει ένα παράδειγμα χρωματογράμματος ιόντων, που δείχνει δύο δείγματα σε αυτόκλειστο παρουσία ή απουσία ΝΑΟΗ.
Συντομογραφίες: BDDE, 1,4-βουτανοδιόλη διγλυκιδυλαιθέρας;LC-MS, υγρή χρωματογραφία και φασματομετρία μάζας.MRM, παρακολούθηση πολλαπλών αντιδράσεων.
Σημείωση: Το άνω χρωματογράφημα: Το δείγμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με υδατικό διάλυμα NaOH 0,1% και αποστειρώθηκε σε αυτόκλειστο (120°C για 20 λεπτά).Χρωματόγραμμα κάτω: Το δείγμα δεν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με NaOH, αλλά αποστειρώθηκε σε αυτόκλειστο υπό τις ίδιες συνθήκες.Η μετατροπή μάζας 203,30/129,10 Da (σε θετικό τρόπο MRM) αναλύθηκε με LC-MS.
Συντομογραφίες: BDDE, 1,4-βουτανοδιόλη διγλυκιδυλαιθέρας;LC-MS, υγρή χρωματογραφία και φασματομετρία μάζας.MRM, παρακολούθηση πολλαπλών αντιδράσεων.
Σε όλα τα δείγματα σε αυτόκλειστο, με ή χωρίς NaOH, η συγκέντρωση BDDE μειώθηκε σημαντικά (έως 16,6 φορές) (δείγματα 5-8, Πίνακας 2).Η μείωση της συγκέντρωσης BDDE μπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι σε υψηλές θερμοκρασίες, το νερό μπορεί να λειτουργήσει ως βάση (πυρηνόφιλο) για να ανοίξει τον εποξειδικό δακτύλιο του BDDE για να σχηματίσει μια ένωση 1,2-διόλης.Η μονοϊσοτοπική ποιότητα αυτής της ένωσης είναι διαφορετική από αυτή του BDDE και επομένως δεν θα επηρεαστεί.Το LC-MS εντόπισε μετατόπιση μάζας 203,30/129,10 Da.
Τέλος, αυτά τα πειράματα δείχνουν ότι η δημιουργία νέων κορυφών εξαρτάται από την παρουσία BDDE, NAOH και τη διαδικασία αποστείρωσης σε αυτόκλειστο, αλλά δεν έχει καμία σχέση με το HA.
Η νέα κορυφή που βρέθηκε σε χρόνο κατακράτησης περίπου 2,71 λεπτών στη συνέχεια χαρακτηρίστηκε με LC-MS.Για το σκοπό αυτό, BDDE (9,9 mg/mL) επωάστηκε σε υδατικό διάλυμα NaOH 1% και αποστειρώθηκε σε αυτόκλειστο.Στον Πίνακα 4, τα χαρακτηριστικά της νέας κορυφής συγκρίνονται με τη γνωστή κορυφή αναφοράς BDDE (χρόνος συγκράτησης περίπου 3,47 λεπτά).Με βάση την ανάλυση κατακερματισμού ιόντων των δύο κορυφών, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι η κορυφή με χρόνο κατακράτησης 2,72 λεπτών δείχνει τα ίδια θραύσματα με την κορυφή BDDE, αλλά με διαφορετικές εντάσεις (Εικόνα 6).Για την κορυφή που αντιστοιχεί στον χρόνο κατακράτησης (PIS) των 2,72 λεπτών, παρατηρήθηκε μια πιο έντονη κορυφή μετά τον κατακερματισμό σε μάζα 147 Da.Στη συγκέντρωση BDDE (9,9 mg/mL) που χρησιμοποιήθηκε σε αυτόν τον προσδιορισμό, παρατηρήθηκαν επίσης διαφορετικοί τρόποι απορρόφησης (UV, λ=200 nm) στο υπεριώδες φάσμα μετά από χρωματογραφικό διαχωρισμό (Εικόνα 7).Η κορυφή με χρόνο συγκράτησης 2,71 λεπτά εξακολουθεί να είναι ορατή στα 200 nm, ενώ η κορυφή BDDE δεν μπορεί να παρατηρηθεί στο χρωματογράφημα υπό τις ίδιες συνθήκες.
Πίνακας 4 Αποτελέσματα χαρακτηρισμού της νέας κορυφής με χρόνο συγκράτησης περίπου 2,71 λεπτά και της κορυφής BDDE με χρόνο συγκράτησης 3,47 λεπτών
Σημείωση: Για να ληφθούν αυτά τα αποτελέσματα, πραγματοποιήθηκαν αναλύσεις LC-MS και HPLC (MRM και PIS) στις δύο κορυφές.Για ανάλυση HPLC, χρησιμοποιείται ανίχνευση UV με μήκος κύματος 200 nm.
Συντομογραφίες: BDDE, 1,4-βουτανοδιόλη διγλυκιδυλαιθέρας;HPLC, υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης.LC-MS, υγρή χρωματογραφία και φασματομετρία μάζας.MRM, παρακολούθηση πολλαπλών αντιδράσεων.m/z, αναλογία μάζας προς φόρτιση.PIS, προϊόν Σάρωση ιόντων.υπεριώδες φως, υπεριώδες φως.
Σημείωση: Τα θραύσματα μάζας λαμβάνονται με ανάλυση LC-MS (PIS).Χρωματόγραμμα κορυφής: φάσμα μάζας τυπικών θραυσμάτων δείγματος BDDE.Κάτω χρωματογράφημα: Το φάσμα μάζας της νέας κορυφής που ανιχνεύθηκε (το RRT που σχετίζεται με την κορυφή BDDE είναι 0,79).Το BDDE υποβλήθηκε σε επεξεργασία σε διάλυμα NaOH 1% και αποστειρώθηκε σε αυτόκλειστο.
Συντομογραφίες: BDDE, 1,4-βουτανοδιόλη διγλυκιδυλαιθέρας;LC-MS, υγρή χρωματογραφία και φασματομετρία μάζας.MRM, παρακολούθηση πολλαπλών αντιδράσεων.PIS, σάρωση ιόντων προϊόντος.RRT, σχετικός χρόνος διατήρησης.
Σχήμα 7 Χρωματόγραμμα ιόντων του προδρόμου ιόντος 203,30 Da, και (Α) η νέα κορυφή με χρόνο κατακράτησης 2,71 λεπτά και (Β) η ανίχνευση UV της τυπικής κορυφής αναφοράς BDDE στα 3,46 λεπτά στα 200 nm.
Σε όλες τις διασυνδεδεμένες υδρογέλες ΗΑ που παράγονται, παρατηρήθηκε ότι η υπολειπόμενη συγκέντρωση BDDE μετά τον ποσοτικό προσδιορισμό LC-MS ήταν <2 ppm, αλλά μια νέα άγνωστη κορυφή εμφανίστηκε στην ανάλυση.Αυτή η νέα κορυφή δεν ταιριάζει με το πρότυπο προϊόν BDDE.Το πρότυπο προϊόν BDDE έχει επίσης υποστεί την ίδια ανάλυση μετατροπής ποιότητας (MRM conversion 203.30/129.10 Da) στη λειτουργία θετικού MRM.Γενικά, άλλες αναλυτικές μέθοδοι όπως η χρωματογραφία χρησιμοποιούνται ως οριακές δοκιμές για την ανίχνευση BDDE σε υδρογέλες, αλλά το μέγιστο όριο ανίχνευσης (LOD) είναι ελαφρώς χαμηλότερο από 2 ppm.Από την άλλη πλευρά, μέχρι στιγμής, το NMR και το MS έχουν χρησιμοποιηθεί για τον χαρακτηρισμό του βαθμού διασύνδεσης και/ή τροποποίησης του ΗΑ στα θραύσματα μονάδας σακχάρου των διασυνδεδεμένων προϊόντων ΗΑ.Ο σκοπός αυτών των τεχνικών δεν ήταν ποτέ ο ποσοτικός προσδιορισμός της υπολειπόμενης ανίχνευσης BDDE σε τόσο χαμηλές συγκεντρώσεις όπως περιγράφουμε σε αυτό το άρθρο (LOD της μεθόδου LC-MS μας = 10 ppb).
Ώρα δημοσίευσης: Σεπ-01-2021